Początki ogrodu sięgają 1918 roku, gdy profesor biologii Stefan Miler założył przy Państwowym Męskim Gimnazjum w Zamościu, jakie mieściło się w budynku dawnej Akademii Zamojskiej, pierwszy w Polsce i jeden z nielicznych w Europie szkolnych ogrodów zoologicznych. Położony obok szkoły ogród zajmował 10 arów. Pierwszymi mieszkańcami zoo były żółwie i zaskrońce, które mieszkały w centralnej części "stawu" zrobionego z niewielkiego wózka, jakiego używa się w cukrowniach do przewożenia buraków. Pierwsza klatka dla wiewiórek powstała z austriackiej budki wartowniczej.
W 1923 roku w zamojskim kinie "Stylowy", gdzie odegrano sztukę Stanisława Młodożeńca, ówczesnego nauczyciela w zamojskim gimnazjum, odbyła się zbiórka pieniędzy, za które zbudowano ptaszarnię. Pierwszymi lokatorami ptaszarni była młoda kukułka i papuga oraz kupione w późniejszym okresie przepiórki, kokoszki wodne i derkacze. Z czasem w zoo pojawiły się m.in. susły, chomiki, króliki i przywieziony z Egiptu przez polskich lotników kameleon. Wilki, które podarował rolnik z Wołynia, początkowo swobodnie biegały po ogrodzie, bawiąc się z turystami. Wszystkie prace w ogrodzie wykonywali głównie uczniowie np. Władysław Kasprowicz.
Jedzenie dla zwierząt było kupowane z prywatnych funduszy profesora oraz datków przyjaciół np. znanego filantropa Jana Zielińskiego. W 1927 roku zoo odwiedził prezydent RP Ignacy Mościcki. Od tego roku przez 3 lata ogród otrzymywał 10 000 zł dotacji z Ministerstwa Wyznań Religijnych i Oświecenia Publicznego. Za dotacje wybudowano m.in. cieplarnię, pomieszczenia dla niedźwiedzi i orła.
Pierwszy niedźwiedź kupiony za uzbierane przez młodzież pieniądze od Starego Zoo w Poznaniu zdechł po godzinnym pobycie w zoo (przyczyn nie ustalono). W 1928 roku kupiono drugiego niedźwiedzia z zoo w Hamburgu, którego nazwano "Miś". w 1929 roku poznańskie zoo przysłało w darze 1,5-roczną niedźwiedzicę Basię. 17 stycznia jest świętem ogrodu. Od tego czasu co dwa lata przybywały młode, których łącznie było 30. Niedźwiadki sprzedawano do ogrodów zoologicznych m.in. w Belgii. W 1931 do zoo sprowadzono pierwszego lwa z Warszawy i nadano mu imię "War", lecz po trzech latach zamieniono go na parę lwiątek, z którymi uwielbiał bawić się Bolesław Leśmian. W 1934 roku do ogrodu przybył ryś z Polesia, ulubieniec prof. Milera, który zabierał go na lekcje, gdzie zwierzę było bardzo spokojne.
Przed wybuchem II wojny światowej zoo w Zamościu otrzymało dwa okazałe lwy od ogrodu w Warszawie. Niedługo potem przyszło na świat ich potomstwo. Niestety pięć lwów padło w czasie wojny, gdy na ogród spadły dwie bomby.
Jadwiga Stoczkowska rozpoczęła pracę w zoo w 1973 roku po skończeniu studiów. Odeszła na emeryturę po 33 latach pracy. Przez ostatnich kilkanaście lat była ona dyrektorem i wicedyrektorem ogrodu. Do historii zoo przeszła także jako matka zastępcza wielu zwierząt. Jej ulubieńcem była wydra o imieniu Pan Wydrzycki. Lew Leon, dawniej wychowywany przez p. Stoczkowską, teraz na stałe mieszka w zoo i do dziś daje się pogłaskać mamie. Leon dwa razy uciekał z zoo. W Zamościu w starym ogrodzie do ucieczek dochodziło dość często. Uciekły m.in. zaskrońce, lisy, wilki, niedźwiedzie.
W roku 1980 ogród zoologiczny przeniesiono na nowy, znacznie większy teren przy ul. Szczebrzeskiej.