Synagoga została zbudowana w latach 1764-1774, prawdopodobnie według projektu Pawła Antoniego Fontana, na miejscu starej, drewnianej synagogi. Część funduszy na jej budowę przeznaczyła rodzina Czartoryskich. W drugiej połowie XIX wieku do synagogi dobudowano drugą kondygnację nad przedsionkiem oraz dwa narożne alkierze.
Podczas I wojny światowej synagoga i całej jej wnętrze spłonęło. Począwszy od czasu zakończenia wojny rozpoczęto remont oraz rekonstrukcje wnętrza. Po 1920 roku wykonano na nowo całą wewnętrzną stolarkę, a w 1936 roku ukończono nowy Aron ha-kodesz.
Podczas II wojny światowej hitlerowcy zdewastowali synagogę i urządzili w niej magazyn sprzętu wojskowego. Po zakończeniu wojny do 1970 roku nadal służyła jako magazyn. W latach 80. przeprowadzono rozległe prace remontowe i konserwacyjne.
Od 1983 roku w synagodze mieści się Muzeum – Zespół Synagogalny we Włodawie (dawniej Muzeum Pojezierza Łęczyńsko-Włodawskiego), ze stałą wystawą poświęconą historii i kulturze polskich i włodawskich Żydów.